一、质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
过程如下:
1. PCR扩增
首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应,它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。其特点是能将微量的 DNA 大幅扩增,在克隆前获得大量的目标基因片段。
简要步骤:利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后,配制 PCR 反应体系:将模板、引物、dNTP酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入,加好后轻微瞬离,放入 PCR 仪中扩增目的片段,扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
2. 酶切连接
获得目标片段后,要交到载体中,必须借助两个工具来实现——酶切工具(限制性内切酶)和连接工具(DNA 连接酶)。
简要步骤:配制琼脂糖凝胶(常用浓度 1-2%)后点样,切胶电泳回收目的片段,选择合适的内切酶将目的片段和质粒载体同时切割,酶切后的片段再次电泳回收,测定浓度后按比例加入 T4 DNA 连接酶,粘性末端载体、目的片段、缓冲液,进行连接后直接转化。
二、质粒是必须进入受体细胞的,它不仅是目的基因的载体,也是目的基因能够在受体细胞中稳定遗传的工具。
把目的基因重组到质粒上主要也是为了能够让其在受体细胞中稳定遗传,因为单独的目的基因无法再受体细胞中稳定遗传到子代中去,而质粒可以很好地起到一个随核基因一块复制和分配到各代子细胞中去的作用
一、需要的仪器主要包括:限制性内切酶、DNA连接酶、PCR机、电泳仪等 。其中,限制性内切酶和DNA连接酶是用于将目标基因与质粒载体进行连接的工具,而PCR机和电泳仪则用于扩增目标基因和检测连接产物 。
二、首先需要一个表达载体,看你需要原核还是真核,看情况选择,然后有获得你需要的目的基因,在两端加酶切位点,将目的基因与载体连接到一起后就完成了质粒载体的构建了。
一、质粒(Plasmid)是一种能自主复制的环状额外染色体DNA元件。它通常携带一定数量的基因,其中有些基因可对不同抗生素产生抗性,该抗性常作为依据,以辨别是否含有此种质粒而识别生物体。
许多细菌除了染色体外,还有大量很小的环状DNA分子,这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因,例如,四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
二、质粒(plasmid) 广泛存在于生物界,从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物,甚至人类机体中都含有。
从分子组成看,有DNA 质粒,也有RNA 质粒; 从分子构型看,有线型质粒、也有环状质粒: 其表型也多种多样。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。
三、质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型,它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中,乃至于植物的叶绿体和线粒体等胞器中。然而,1984年,在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中,又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面,有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数(copy number)在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力,乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。